Toimittanut Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, California, hyväksytty 25. joulukuuta 2020 (tarkistettu 25. lokakuuta 2020)
Raportoimme alayksiköiden välisestä vuorovaikutuksesta replikaation ja evolutionaarisen säilymisen kannalta välttämättömien koronavirus-transkriptiokompleksien replikaatiossa.Esitimme todisteita siitä, että nsp12:een liittyvällä NiRAN-domeenilla on nukleosidimonofosfaatti (NMP) -transferaasiaktiivisuutta in trans, ja tunnistimme nsp9:n (RNA:ta sitovan proteiinin) kohteena.NiRAN katalysoi NMP-osan kovalenttista kiinnittymistä konservoituneeseen nsp9-aminopäähän reaktiossa, joka perustuu Mn2+-ioneihin ja viereisiin konservoituneisiin Asn-tähteisiin.Havaittiin, että NiRAN-aktiivisuus ja nsp9 NMPylaatio ovat välttämättömiä koronaviruksen replikaatiolle.Tietojen avulla voimme yhdistää tämän sisäkkäisen viruksen entsyymimarkkerin aktiivisuuden aikaisempiin havaintoihin hypoteesissa, jonka mukaan RNA-synteesin aloitus RNA-virusten luokassa on toiminnallisesti ja evoluutionaalisesti johdonmukaista.
Nidoviralesin (Coronaviridae, Arterioviridae ja 12 muun perheen) RNA-riippuvainen RNA-polymeraasi (RdRps) on kytketty polyproteiinista vapautuvan ei-rakenneproteiinin (nsp) aminoterminaaliseen (N-terminaaliseen) domeeniin, nimeltään NiRAN. 1ab koostuu viruksen pääproteaasista (Mpro).Aikaisemmin valtimoviruksen NiRAN-RdRp nsp:n omasta GMPylaatio-/UMPylaatioaktiivisuudesta on raportoitu, ja ehdotettiin, että saataisiin aikaan ohimenevä nukleosidimonofosfaatin (NMP) siirtyminen (tällä hetkellä tuntemattomiin) viruksiin ja/tai solujen biopolymerointiin.Tässä osoitamme, että koronaviruksella (ihmisen koronavirus [HCoV]-229E ja vakava akuutti hengitystieoireyhtymä Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) on Mn2+:sta riippuvainen NMPylaatioaktiivisuus, joka on peräisin nsp9:stä Mpro-välitteisen nsp9:n muodostumisen jälkeen. N-pään viereinen nsps vapautuu proteolyyttisesti, fosforamidaatti sitoutuu primääriseen amiiniin (N3825) nsp9:n N-päässä.Uridiinitrifosfaatti on edullinen nukleotidi tässä reaktiossa, mutta adenosiinitrifosfaatti, guanosiinitrifosfaatti ja sytidiinitrifosfaatti ovat myös sopivia kosubstraatteja.Mutaatiotutkimukset, joissa käytettiin yhdistelmäkoronaviruksen nsp9- ja nsp12-proteiineja ja geneettisesti muokattuja HCoV-229E-mutantteja, määrittelivät NiRAN-välitteiselle nsp9-NMPylaatiolle ja viruksen replikaatiolle soluviljelmässä tarvittavat tähteet.Tiedot vahvistivat NiRAN-aktiivisen kohdan tähteiden ennusteen ja määrittelivät nsp9 N3826 -tähteiden tärkeän roolin nsp9:n NMPylaatiossa ja viruksen replikaatiossa in vitro.Tämä tähde on osa konservoitunutta N-terminaalista NNE-tripeptidisekvenssiä ja osoittautui ainoaksi invariantiksi nsp9:n ja sen homologien tähteeksi koronavirusperheessä.Tämä tutkimus tarjoaa vankan perustan muiden sisäkkäisten virusten NMPylaatioaktiivisuuden toiminnalliselle tutkimukselle ja ehdottaa mahdollisia kohteita viruslääkkeiden kehittämiselle.
Nidovirales-positiivinen juosteinen RNA-virus infektoi useita selkärankaisia ja selkärangattomia (1, 2).Tilaukseen kuuluu tällä hetkellä 14 perhettä (3), joista koronavirusperhettä on tutkittu laajasti viimeisen 20 vuoden aikana.Tuolloin eläinisännistä nousi kolme zoonoottista koronavirusta, jotka aiheuttivat laajamittaisia vakavia hengitystieinfektioita ihmisissä.Mukaan lukien vakavien akuuttien tartuntatautien aiheuttamat jatkuvat pandemiat.Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidoviruksilla on yhteinen genomiorganisaatio, ja kalvoon sitoutuneen replikaatio-transkriptiokompleksin (RTC) alayksikkö on koodattu viruspartikkelin 5-β²-pään kahdessa kolmasosassa ja päärakenteellisessa alayksikössä, samoin kuin joitain lisälaitteita. .Proteiini, koodattu genomin 3??²:n loppukolmanneksessa (1).Lukuun ottamatta yhtä tasomaisten virusten perhettä (Monoviridae) (8), kaikki sisäkkäiset virukset koodaavat RTC-alayksiköitä kahdessa suuressa avoimessa lukukehyksessä (ORF) ORF1a ja ORF1b, jotka transloidaan genomisesta RNA:sta.ORF1a koodaa polyproteiinia (pp) 1a, ja ORF1a ja ORF1b koodaavat yhdessä pp1ab:tä.ORF1a:n koodaaman pääproteaasin (Mpro) yleisellä osallistumisella sekä pp1a että pp1ab prosessoidaan proteolyyttisesti useiksi ei-rakenneproteiineiksi (nsps), jotka tunnetaan myös nimellä 3CLpro, koska sillä on homologiaa picornaviruksen 3Cpro:n kanssa ( 9).Näiden nsps:iden uskotaan koottavan suureksi dynaamiseksi RTC:ksi, katalysoivan genomisen RNA:n synteesiä (replikaatio) ja joukon subgenomista RNA:ta (transkriptio) ja niitä käytetään koordinoimaan ORF1b:n alavirtaan sijaitsevan ORF:n ilmentymistä (10p?). 12).
Ydin-RTC sisältää RNA-riippuvaisen RNA-polymeraasin (RdRp) (13), superperheen 1 helikaasin (HEL1) (14, 15) ja useita RNA:ta prosessoivia entsyymejä, joita pääasiassa koodaa ORF1b ja koronavirusperhe. Se sisältää nsp12-nsp16 ja nsp9-nsp12 Arterioviridae-perheessä (katso viite 10ââ 12).RdRp ja HEL1 edustavat kahta (viidesosaa) konservoitunutta domeenia linnunpesäviruksesta ja niillä on homologiaa muiden RNA-virusten kanssa.Ydinreplikaasia uskotaan avustavan muiden alayksiköiden, mukaan lukien useat pienet nsp:t, jotka vapautuvat pp1a:n karboksiterminaaliselta (C-terminaaliselta) alueelta Mpro:n alavirtaan (koronaviruksen nsp5 ja valtimoviruksen nsp4, vastaavasti).Heillä on rajoitettu perhekohtainen suojelu ja monipuolinen toiminta (tarkisteltu viitteessä 10âââ12).
Suhteellisen äskettäin kaikkien sisäkkäisten virusten aminopäästä (N-päästä) löydettiin RdRp:n vieressä oleva domeeni, jolla on ainutlaatuiset sekvenssimotiiviominaisuudet, mutta ei muita RNA-viruksia (16).Sijaintinsa ja nukleotiditransferaasin (nukleosidimonofosfaatti [NMP] transferaasi) aktiivisuuden perusteella tämä domeeni on nimeltään NiRAN (Nestvirus RdRp:hen liittyvä nukleotiditransferaasi).NiRAN-RdRp:n kaksidomeeniyhdistelmä muodostaa nsp12:n Coronaviridae-perheessä ja nsp9:n Arterioviridae-perheessä, ja muissa nestoviridae-heimoissa NiRAN-RdRp:n odotetaan vapautuvan itsenäisenä nsp:nä viruksen polyproteiinista.Koronaviruksessa NiRAN-domeeni sisältää A1/450 tähdettä ja on kytketty C-terminaaliseen RdRp-domeeniin linkkerialueen (16-19) kautta.Hevosen valtimotulehdusviruksessa (EAV) (Arteriviridae) yhdistelmä-nsp9 osoittaa Mn2+-ionista riippuvaisia (itse) UMPylaatio- ja GMPylaatioaktiivisuuksia, jotka riippuvat kolmesta konservoituneesta sekvenssiemäksestä nestoviruksessa, AN, BN ja CN. Sekvenssin tähteet.Missä N tarkoittaa NiRAN) (16).Näiden motiivien N-terminaalinen sivu on vähemmän konservatiivinen motiivi preAN.Jotkut näistä tähteistä ovat myös konservoituneita kaukaa sukulaisissa proteiinikinaaseissa, joissa niiden on osoitettu osallistuvan nukleosiditrifosfaatin (NTP) sitoutumiseen ja katalyyttiseen aktiivisuuteen (20, 21).Tämän havainnon mukaisesti useita keskeisiä aktiivisen kohdan tähteitä Pseudomonas syringaen pseudokinaasi SelO:ssa voidaan koota äskettäin julkaistun SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 -superkompleksin kanssa.Koronaviruksen konservoituneet NiRAN-tähteet päällekkäin elektronien mikrorakenteessa.Rekombinanttiproteiini (17).Spekuloidaan, että dokumentoitu (itse) U/GMPylaatio tuottaa ohimenevän tilan siirtääkseen NMP:tä (tällä hetkellä tuntemattomaan) substraattiin (16), ja NiRANin ja proteiinikinaasin rakenteellisen samankaltaisuuden (17, 19) ) Onko hypoteesi, että NiRAN muokkaa muita proteiineja.
Monet ominaisuudet, mukaan lukien sen ainutlaatuinen ja ainutlaatuinen systemaattinen assosiaatio sisäkkäisiin viruksiin ja geneettinen erottaminen RdRp:stä, tekevät NiRANista kohtuullisen avainsäätelyentsyymin sisäkkäisille viruksille, mikä on kriittistä niiden syntymiselle ja identiteetille.Aikaisemmin kutsuttiin kolme mahdollista toimintoa, joihin NiRAN osallistui genomin/subgenomisen translaation tai replikaation/transkription säätelemiseksi.Kun otetaan huomioon tuolloin saatavilla olevat niukat ja epätäydelliset tiedot, jokaisella toiminnolla on etunsa ja haittansa (16).Tässä tutkimuksessa pyrimme yhdistämään kahta sukua edustavien koronavirusten biokemialliset ja käänteisgeneettiset tutkimukset ja sijoittamaan havainnot koronavirusperheen luonnollisen mutaation evoluutiotaustalle saadaksemme käsityksen tähän Mysteerimaailmaan.Raportoimme suuria edistysaskeleita NiRAN:n ymmärtämisessä tunnistamalla luonnollisia kohteita RTC:ssä, mikä (kolmen käytettävissä olevan hypoteesin joukossa) myötävaikuttaa tämän domeenin rooliin sisäkkäisen viruksen RNA:n synteesin käynnistämisessä.Tämä tutkimus avaa myös mahdollisuuksia NiRANin muille rooleille virusisäntärajapinnassa.
Koronaviruksen nsp12:een liittyvän NiRAN-domeenin entsymaattisten ominaisuuksien karakterisoimiseksi tuotimme ihmisen koronaviruksen 229E (HCoV-229E) nsp12:n rekombinanttimuodon E. colissa, jossa oli His6-merkki C-päässä, ja yhdistimme proteiini [a32-P]:n kanssa Inkuboi yhdessä NTP:n kanssa MnCl2:n läsnä ollessa kohdassa Materiaalit ja menetelmät kuvatulla tavalla.Reaktiotuotteen analyysi osoitti radioleimatun proteiinin läsnäolon, joka liikkui yhdessä nsp12:n (106 kDa) kanssa, mikä osoittaa, että koronavirus nsp12 katalysoi kovalenttisten proteiini-NMP-adduktien muodostumista, jotka muodostuvat ensisijaisesti uridiinimonofosfaatin (UMP) kanssa (kuva 1A). B).Kvantitatiivinen analyysi osoitti, että muihin nukleotideihin verrattuna UMP:n liittämisen signaalin intensiteetti kasvoi 2-3 kertaa (kuvio 1C).Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia koronaviruksen NiRAN-domeenin ennustetun NMP-transferaasiaktiivisuuden kanssa (16), mutta osoittavat, että koronaviruksen ja valtimoviruksen NiRAN-domeenin nukleotidipreferenssit ovat erilaisia.
HCoV-229E nsp12:n itse-NMPylaatioaktiivisuus.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) inkuboitiin nimetyn [a-32P] NTP:n kanssa 6 mM MnCl2:n läsnä ollessa 30 minuuttia (katso materiaalit ja menetelmät yksityiskohtia varten).Reaktiotuotteet erotettiin SDS-PAGE:lla ja värjättiin Coomassie briljanttisinisellä.(B) Radioleimattu proteiini visualisoidaan fosforikuvauksella.Nsp12-His6:n ja proteiinin molekyylimassamarkkerien sijainnit (kilodaltoneina) on esitetty kohdissa A ja B. (C) Radioaktiivisen signaalin intensiteetti (keskiarvo ± SEM) määritettiin kolmesta riippumattomasta kokeesta.*P≤0,05.Signaalin voimakkuus (prosentti) liittyy UTP:hen.
Vaikka NiRANiin liittyvien entsyymiaktiivisuuksien on osoitettu olevan välttämättömiä EAV:n ja SARS-CoV:n replikaatiolle soluviljelmässä (16), spesifistä NiRAN-toimintoa ja mahdollisia kohteita ei ole vielä määritetty.Äskettäin raportoitu rakenteellinen samankaltaisuus NiRANin ja proteiiniperheen välillä, joissa on proteiinikinaasin kaltaisia laskoksia (17, 22), sai meidät testaamaan hypoteesia, että NiRAN katalysoi muiden proteiinien NMPylaatiota.Loimme joukon mahdollisia homologisia kohteita, mukaan lukien HCoV-229E ORF1a:n (nsps 5, 7, 8, 9, 10) koodaamat ei-rakenneproteiinit, joista jokainen sisältää C-terminaalisen His6-tunnisteen (SI-liite, taulukko S1) ja inkuboi näitä proteiineja [a32-P]-uridiinitrifosfaatin ([a32-P]UTP) kanssa nsp12:n läsnä ollessa tai ilman.Naudan seerumin albumiini ja E. colissa tuotettu MBP-LacZa-fuusioproteiini toimivat kontrolleina (kuvio 2A, kaistat 1-7).Radioleimattu proteiini analysoitiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja autoradiografialla, ja havaittiin, että nsp12:ta ja nsp9:ää sisältävässä reaktiossa oli voimakas radioaktiivinen signaali.Signaalin sijainti vastaa nsp9:n molekyylimassaa, mikä osoittaa nsp9:n nsp12-välitteisen UMPylaation (kuvio 2B, raita 7).Muiden testiproteiinien ei havaittu olevan UMPyloituneita, mikä johti päättelemään, että nsp9 on nsp12:n spesifinen substraatti.Kuvassa 1 esitettyjen itse-NMPylaatiotietojen mukaisesti nsp12 pystyy siirtämään kaikki neljä NMP:tä nsp9:ään, vaikka tehokkuus on erilainen, UMP> adenosiinimonofosfaatti (AMP)> guanosiinimonofosfaatti (GMP)> sytidiinimonofosfaatti (CMP)) ( Kuva).3 A ja B).Tässä määrityksessä käytetyissä olosuhteissa (lyhennä reaktio- ja altistusaikaa, vähennä nsp12:n pitoisuutta; materiaalit ja menetelmät) nsp12:n itse-NMPylaatiota ei voitu havaita (vertaa kuva 2B, kaista 7 ja kuva 1B), mikä osoittautui tehokkaaksi (Ja useita kierroksia) UMP siirrettiin nsp12:sta nsp9:ään.UMP-transferaasiaktiivisuus edellyttää Mn2+-ionien läsnäoloa, kuten kuvassa 3C esitetään, kun taas vain minimaalista UMP-transferaasiaktiivisuutta havaittiin Mg2+:n läsnä ollessa, eikä aktiivisuutta kahden muun testatun kaksiarvoisen kationin läsnä ollessa.Samanlaisia tietoja saatiin NMPylaatiomäärityksissä, jotka sisälsivät sytidiinitrifosfaattia (CTP), guanosiinitrifosfaattia (GTP) ja adenosiinitrifosfaattia (ATP) (SI-liite, kuva S1).
HCoV-229E nsp12-välitteinen nsp9:n UMPylaatio.Sarjaa proteiinisubstraatteja (mukaan lukien naudan seerumin albumiini, MBP-lacZα ja sarja HCoV-229E nsps:itä, jotka oli leimattu ORF1a:n koodaamalla C-terminaalisella His6:lla) käytettiin HCoV-229E nsp12-His6⁺-välitteisen UMPylaatioaktiivisuuden arvioimiseen. proteiinia.Inkuboi proteiinia [a-32P] UTP:n kanssa 10 minuuttia nsp12:n poissa ollessa (A) tai läsnä ollessa (B), kuten on kuvattu materiaaleissa ja menetelmissä.A:n ja B:n yläosassa näkyy Coomassie Brilliant Bluella värjätty SDS-polyakryyliamidigeeli ja A:n ja B:n alaosassa vastaavat autoradiogrammit.Proteiinin molekyylimassamarkkerin sijainti (kilodaltoneina) on annettu vasemmalla.Nsp12-His6:n sijainti (B, ylhäällä) ja radioaktiivinen signaali, joka havaittiin inkuboitaessa nsp12-His6:ta nsp9-His6:n kanssa (B, kaista 7), on myös osoitettu, mikä osoittaa, että [α-32P]UMP nsp9-His6:ksi (12,9 kDa), jota ei havaittu muiden testattujen proteiinien osalta.
HCoV-229E NiRAN-välitteinen nsp9 NMPylaation biokemiallinen ja virologinen karakterisointi.(A ja B) Reaktiossa käytetyn nukleotidikomisubstraatin rooli.Nsp12-His6 ja nsp9-His6 sekoitetaan ja inkuboidaan erilaisten [a-32P] NTP:iden läsnä ollessa standardissa NMPylaatiomäärityksessä.(A, ylhäällä) Coomassie-värjätty nsp9-His6 erotettu SDS-PAGE:lla.(A, pohja) Autoradiografia geelin samalta alueelta.(B) Suhteellinen aktiivisuus (keskiarvo ± SEM) määrätyn nukleotidikofaktorin läsnä ollessa määritetään kolmesta riippumattomasta kokeesta.*P≤0,05.(C) Metalli-ionien rooli.Esitetty on standardi NMPylaatiotesti [a-32P] UTP:n ja erilaisten metalli-ionien läsnä ollessa, kunkin konsentraatiolla 1 mM.C:ssä on ylhäällä Coomassie-värjätty nsp9-His6 ja C:ssä alaosassa vastaava autoradiografia.Leimatun proteiinin koko (kilodaltoneina) näytetään A:n ja C:n vasemmalla puolella. (D) HCoV-229E nsp12-His6:n mutanttimuoto, joka sisältää määritellyn aminohapposubstituution, on [a-32P]UTP:ssä, kuten on kuvattu materiaaleissa ja menetelmissä.NMPylaatioreaktiossa tuotettu radioleimattu nsp9-His6 havaitaan fosforylaatiokuvauksella (D, ylhäällä).Suhteellinen aktiivisuus verrattuna villityypin (wt) proteiiniin esitetään D:ssä, ja pohja on otettu kolmen riippumattoman kokeen keskiarvona (± SEM).Tähdet osoittavat ei-konservoituneiden tähteiden substituutioita.(E) Virustiitteri p1-solujen viljelmän supernatantissa, joka oli saatu 24 tuntia infektion jälkeen, määritettiin plakkimäärityksellä.Muokatun HCoV-229E-mutantin NiRAN-domeenin kodonisubstituutiot on osoitettu (tähteiden numerointi perustuu niiden sijaintiin pp1ab:ssa).Replikaatiovajeista RdRp-aktiivisen kohdan mutanttia nsp12_DD4823/4AA käytettiin kontrollina.
Ymmärtääksemme NiRANin aktiivista kohtaa ja määrittääksemme nsp9-spesifisen NMP-transferaasin aktiivisuuteen liittyvät tähteet, suoritimme mutaatioanalyysin, jossa korvasimme konservatiiviset tähteet NiRAN AN-, BN- ja CN-motiiveissa ( 16) Se on Ala (SI-liite, kuva S2).Lisäksi konservatiivisten Arg-to-Lys- tai Lys-to-Arg-substituutioiden vaikutus arvioitiin kahdessa tapauksessa.(Negatiivisena) kontrollina koronavirusten ja muiden sisäkkäisten virusten NiRAN-domeenissa konservoitumattomat tai vähemmän konservoituneet tähteet korvataan Alalla. Korvaa K4116A (aiheessa preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motiivi) BN) ja D4280A (CN) vähentävät merkittävästi tai jopa eliminoivat nsp9:n NMPylaatiota nsp12:n kautta, kun taas proteiinit, joissa on konservatiivisia substituutioita (R4178K) , K4116R) säilyttävät 60 % ja 80 % aktiivisuudestaan, mikä osoittaa, että rajoitusten lieventyminen omalla puolellaan ketjut on fysikaalis-kemiallisesti herkkä (kuva 3D).Useiden muiden säilyneiden jäämien E4145A, D4273A, F4281A ja D4283A korvaaminen on paljon vähemmän haitallista, ja nsp9 UMPylaatio vähenee vain kohtalaisesti.Samanlaisia tuloksia saatiin nsp9:n NMPylaatioreaktioissa, joissa oli mukana muita NTP:itä (kuvio 3D ja SI-liite, kuva S3), mikä vahvistaa, että havaitut vaikutukset spesifisiin aminohapposubstituutioihin ovat riippumattomia käytetyn nukleotidikomisubstraatin tyypistä.Seuraavaksi testasimme näiden nsp12-substituutioiden mahdollista vaikutusta koronavirusten replikaatioon soluviljelmässä.Tätä tarkoitusta varten käytimme sopivia geneettisesti muokattuja komplementaarisia DNA- (cDNA) -templaatteja, jotka oli kloonattu rekombinanttiseen vacciniavirukseen (23, 24) 5-7-solujen transkriptioon.Näissä soluissa tuotettujen tarttuvien virusten jälkeläisten titraus osoitti, että useimmat HCoV-229E NiRAN-mutantit eivät olleet mahdollisia (kuvio 3E).Ryhmä ei-elinkykyisiä virusmutantteja sisältää vaihtoehtoja, joiden on osoitettu eliminoivan tai merkittävästi vähentävän NMP-transferaasiaktiivisuutta in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), mutta on olemassa kaksi muuta vaihtoehtoa (K4116R, E4145A) % varattu?Niiden in vitro NMPylaatioaktiivisuus viittaa siihen, että asiaan liittyy lisärajoituksia.Samalla tavalla kaksi muuta mutaatiota (R4178K, F4281A), jotka aiheuttivat kohtalaisen laskun NiRANin in vitro NMPylaatioaktiivisuudessa, tuottivat eläviä viruksia, mutta nämä virukset vähensivät merkittävästi tiittereitä replikaation kautta.Kuvassa 3D esitettyjen in vitro -aktiivisuustietojen mukaisesti korvaamalla neljä muuta jäännöstä, jotka eivät ole konservoituneita koronaviruksessa ja/tai muissa sisäkkäisissä viruksissa (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16), tuottivat elinkelpoisia viruksia. kohtalaisen alentunut tiitteri verrattuna villityypin virukseen (kuvio 3E).
Sen tutkimiseksi, riippuuko NiRAN-välitteinen NMP-transferaasiaktiivisuus aktiivisesta RdRp-domeenista, kaksi konservoitunutta Asp-tähdettä, jotka osallistuvat kahdenarvoisten metalli-ionien koordinointiin (11) RdRp-motiivissa C, korvattiin Alalla. Tuloksena oleva proteiini nsp12_DD4823/4AA säilyy. sen nsp9 NMPylaatioaktiivisuus, mikä osoittaa, että nsp12-välitteinen in vitro nsp9 NMPylaatioaktiivisuus ei vaadi polymeraasiaktiivisuutta (SI-liite, kuva S4).
Kun nsp9-spesifinen NMP-transferaasiaktiivisuus nsp12:lle oli määritetty, yritimme karakterisoida NMP-nsp9-adduktin massaspektrometrialla (MS).Rekombinantin HCoV-229E nsp9:n täydellinen proteiinimassaspektri osoitti huipun 12 045 Da:ssa (kuvio 4A).Nsp12:n lisääminen ei muuttanut nsp9:n laatua, mikä osoittaa, että nsp12 ja nsp9 eivät muodostaisi stabiilia kompleksia käytetyissä olosuhteissa (denaturaatio) (kuva 4A).UTP:n ja GTP:n läsnä ollessa nsp9:n ja nsp12:n sisältävän reaktion massan mittaus osoitti, että UTP:n proteiinimassa liikkui 306 Da ja GTP:n proteiinimassa liikkui 345 Da, mikä osoittaa, että jokainen nsp9-molekyyli sitoo UMP:tä tai GMP:tä. (Kuva 4) C ja D).Spekuloidaan, että NiRAN-välitteiseen nsp9 NMPylaatioon tarvittava energia tulee NTP-hydrolyysistä ja pyrofosfaatin vapautumisesta.Vaikka tässä reaktiossa käytettiin 10-kertaista mooliylimäärää nsp9:tä (kohde) kuin nsp12:ta (entsyymiä), havaittiin nsp9:n lähes täydellinen NMPylaatio, mikä osoittaa, että nsp12:n ja nsp9:n välinen vuorovaikutus on lyhytikäinen ja nsp12 voi NMPyloida enemmän nsp9:ää. in vitro -molekyyli.
Nsp9:n yksittäinen NMPylaatio nsp12:n ja UTP:n tai GTP:n läsnä ollessa.Näytetään HCoV-229E nsp9:n (SI-liite, taulukko S1) (AD) dekonvoluutoitu täydellinen proteiinimassaspektri.(A) nsp9 yksin, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP:n läsnä ollessa, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP:n läsnä ollessa.
Nsp12:n UMPyloimien nsp9-tähteiden määrittämiseksi nsp9-UMP pilkottiin trypsiinillä.Tuloksena saadut peptidit erotettiin nanokorkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC) ja analysoitiin tandem-massaspektrometrialla (MS/MS) verkossa.Tietojen analyysi käyttäen Byonic-ohjelmistopakettia (Protein Metrics) osoitti N-terminaalisen aminohapon UMPylaation.Tämä vahvistetaan manuaalisesti.Prekursoripeptidin [UMP]NNEIMPGK (SI-liite, kuva S5A) tandem-massaspektri paljasti fragmentin taajuudella 421 m/z, mikä osoittaa, että UMP sitoutuu nsp9:n tähteeseen 1.
Nsp9:n N-päässä Asn on konservoitunut Orthocoronavirinaen jäsenten keskuudessa (SI-liite, kuva S6).Vaikka uskomme, että N-terminaalinen primaarinen amiinityppi on todennäköisin UMP:n akseptori, päätimme hankkia lisätodisteita NMP:n sitoutumisesta N-päässä.Tästä syystä HPLC:llä puhdistettu NMPyloimaton ja NMPyloitu N-terminaalinen peptidi nsp9 johdettiin asetonin ja natriumsyaaniboorihydridin läsnä ollessa.Näissä olosuhteissa vain vapaita primäärisiä amiineja voidaan modifioida propyylillä (25).N-terminaalinen nsp9-peräinen peptidi, jonka sekvenssi on NNEIMPGK, sisältää kaksi primääristä amiinia, yhden Asn:n N-päässä ja toisen Lys:n sivuketjussa C-päässä.Siksi propyyliryhmiä voidaan lisätä molempiin päihin.NMPyloimattomien peptidien uutetut ionikromatogrammit on esitetty SI-liitteen kuvassa S5B.Kuten odotettiin, N-terminaaliset ja C-terminaaliset (mono)propyloidut (SI-liite, kuva S5B, ylempi kaista) ja dipropyloidut peptidit (SI-liite, kuva S5B, alempi kaista) voidaan tunnistaa.Tämä kuvio muuttuu käytettäessä nsp9:n NMPyloitua N-terminaalista peptidiä.Tässä tapauksessa vain C-terminaaliset propyloidut peptidit voidaan tunnistaa, mutta N-terminaalisia propyloituja peptidejä ja dipropyloituja peptidejä ei tunnisteta (SI-liite, kuva S5C), mikä osoittaa, että UMP on siirtynyt N-terminaaliseen primääriseen amiiniin Tämän estämiseksi ryhmää tekemästä muutoksia.
Seuraavaksi korvaamme (Alalla tai Serillä) tai poistamme konservoidut tähteet nsp9:n N-päästä määrittääksemme kohdekohtaiset rajoitukset.Perustuen MS-tietojemme, joka osoittaa, että NiRAN muodostaa nsp9-NMP-adduktin nsp9:n N-terminaalisen tähteen primaarisen amiinin kanssa, oletimme, että nsp9 NMPylaatio vaatii viruksen pääproteaasin (Mpro, nsp5) vapauttamaan nsp9:n N-pään sen polyproteiinien esiaste.Tämän hypoteesin testaamiseksi tuotimme nsp9:n sisältävän prekursoriproteiinin nsp7-11 E. colissa ja suoritimme standardin NMPylaatiotestin [α-32P] UTP:n läsnä ollessa (materiaalit ja menetelmät).Kuten kuviossa 5A (kaista 3) esitetään, leikkaamaton nsp7-11-prekursori ei ole radioleimattu nsp12:lla.Sitä vastoin, jos rekombinantti nsp5 pilkkoo nsp7-11:n nsp9:n (ja muiden nsp-proteiinien) vapauttamiseksi prekursorista, havaitaan radioaktiivisesti leimattu proteiini, joka kulkeutuu nsp9:n kanssa, mikä vahvistaa päätelmämme, että NiRAN ja N-selektiivinen kovalenttisten nsp9-NMP-adduktien muodostuminen .N-terminaalisen Asn:n terminaalinen primaarinen amiini (asema 3825 pp1a/pp1ab:ssa).Tätä päätelmää tukevat myös kokeet, joissa käytettiin nsp9-konstruktia, joka sisältää yhden tai kaksi lisätähdettä N-päässä.Molemmissa tapauksissa nsp9:n NiRAN-välitteinen UMPylaatio poistettiin (SI-liite, kuva S7).Seuraavaksi tuotimme proteiinin, jossa yksi tai kaksi Asn-tähdettä oli deletoitu 3825-NNEIMPK-3832-peptidisekvenssistä nsp9:n N-päästä.Molemmissa tapauksissa nsp9 UMPylaatio estettiin kokonaan (kuvio 5B), mikä tarjosi lisätodisteita siitä, että todellinen nsp9:n N-pää toimii NMP-reseptorina.
Nsp9:n proteolyyttinen prosessointi ja N-terminaalisten tähteiden rooli nsp12-välitteisessä UMPylaatiossa.(A) nsp9 UMPylaatio vaatii vapaan nsp9 N-terminaalin.Nsp7-11-His6 esi-inkuboidaan 30 °C:ssa NMPylaation detektiopuskurissa, joka sisältää UTP:tä rekombinantin Mpro:n (nsp5-His6) läsnä ollessa tai poissa ollessa.3 tunnin kuluttua aloita NMPylaatiomääritys lisäämällä nsp12-His6, kuten on kuvattu kohdassa Materiaalit ja menetelmät.Reaktiota, joka sisälsi nsp5-His6 (kaista 1) ja nsp9-His6 (kaista 2), käytettiin kontrollina.10 minuutin kuluttua reaktio lopetettiin ja reaktioseos erotettiin SDS-PAGE:lla.Proteiini värjättiin Coomassie Brilliant Bluella (A, ylhäällä).Nsp7-11-His6-prekursori ja prosessoitu tuote, joka on tuloksena nsp5-His6-välitteisestä pilkkoutumisesta, on esitetty oikealla.Huomaa (pienen koonsa vuoksi), että nsp7 ja nsp11-His6 eivät ole havaittavissa tässä geelissä, ja reaktiota täydennetään nsp5-His6:lla (kaistat 1 ja 4; nsp5-His6:n sijainti on merkitty kiinteällä ympyrällä) tai nsp9-His6 (kaista 2) sisältää pienen määrän MBP:tä (merkitty avoimilla ympyröillä) jäännösepäpuhtauksina, koska ne ilmentyvät MBP-fuusioproteiineina (SI-liite, taulukko S1).(B) Nsp9-His6-variantista puuttuu yksi tai kaksi N-terminaalista Asn-tähdettä (tähteiden numerointi pp1a/pp1ab:n sijainnin mukaan), ja se puhdistetaan ja inkuboidaan nsp12-His6:n ja [a-32P]UTP:n kanssa.B, Coomassiella värjätty SDS-PAGE näkyy ylhäällä, B, vastaava autoradiografi on esitetty alaosassa.Molekyylipainomarkkerin sijainti (kilodaltoneina) näkyy vasemmalla.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-pään konservoituneet tähteet korvattiin Alalla tai Serillä, ja sama määrä proteiinia käytettiin nsp12-His6-välitteisessä UMPylaatioreaktiossa.Reaktiotuotteet erotettiin SDS-PAGE:lla ja värjättiin Coomassie Brilliant Bluella (C, yläosa), ja radioleimattu nsp9-His6 havaittiin fosforesenssikuvauksella (C, keskellä).Käyttämällä villityypin (wt) proteiinia vertailuna (asetettu 100 %) suhteellinen NMPylaatioaktiivisuus (keskiarvo ± SEM) laskettiin kolmesta riippumattomasta kokeesta.(D) Virustiitterit HCoV-229E-villityypin Huh-7-soluilla infektoitujen Huh-7-solujen ja nsp9:ssä määrättyjä aminohapposubstituutioita sisältävien mutanttien p1-soluviljelmän supernatantissa määritettiin plakkimäärityksellä.Replikaatiopuutteista RdRp-motiivi C-kaksoismutanttia DD4823/4AA käytettiin negatiivisena kontrollina.
Nsp9:n N-pää (erityisesti paikat 1, 2, 3 ja 6) on hyvin konservoitunut Orthocoronavirinae-alaheimon jäsenillä (SI-liite, kuva S6).Näiden tähteiden mahdollisen roolin tutkimiseksi nsp12-välitteisessä nsp9-NMPylaatiossa kaksi peräkkäistä Asn-tähdettä nsp9:n N-päässä korvattiin Alalla tai Serillä (yksin tai yhdistelmänä).Villityypin nsp9:ään verrattuna N3825:n korvaaminen Alalla tai Serillä johti yli kaksinkertaiseen vähenemiseen nsp12-välitteisessä UMPylaatiossa (kuvio 5C).Johdonmukaisesti johtopäätöksemme kanssa, jonka mukaan NMPylaatio tapahtuu N-terminaalisessa primaarisessa amiinissa N-terminaalisen tähteen sivuketjun sijasta, havaitsimme merkittävää jäännös-NMPylaatiota korvaamalla N3825A ja N3825S.Mielenkiintoista on, että jos toinen Asn korvataan Alalla tai Serillä, nsp9:n UMPylaatio vähenee voimakkaammin (yli 10 kertaa), kun taas Ala:n korvaamisella asemissa 3, 4 ja 6 on vain kohtalainen vaikutus nsp9:n UMPylaatioon (kuva 2). ) .5C).Samanlaisia tuloksia saatiin käyttämällä ATP:tä, CTP:tä tai GTP:tä (SI-liite, kuva S8).Yhdessä nämä tiedot osoittavat N2826:n (sijainti 2 nsp9:ssä) avainroolin nsp9:n NMPylaatiossa.
Saadaksemme lisätodisteita nsp9:n N-pään ja NMPylaation välisestä toiminnallisesta korrelaatiosta, suoritimme Coronavirus-perheen nsp9-sekvenssin monisekvenssikohdistuksen (MSA) (vaihtelee 104 ja 113 tähteen välillä) (SI-liite, kuva S6).Kaiken kaikkiaan 47 (tunnetussa ja oletetussa) lajissa Orthocoronavirinae-alaheimon 5 suvusta, jotka infektoivat erilaisia nisäkkäitä, lintuja ja matelijaisäntiä, vain 8 jäännöstä havaittiin olevan muuttumattomia.Laajimmat muutokset, mukaan lukien deleetiot ja insertiot, havaittiin nsp9:n sekundaarirakenteen elementtien välisissä sykleissä, kuten aikaisemmat rakennetutkimukset ovat määrittäneet (26 x 28).Viisi muuttumatonta tähdettä löydettiin nsp9:n C-terminaalisen osan β-juosteesta ja α-kierteestä.Kolme muuttumatonta tähdettä muodostavat nsp9:n N-pään NNE-motiivin.Paljastetaan, että tämän motiivin toinen Asn on ainoa muuttumaton jäännös, jonka jakaa myös kaukaa sukua olevan sammakon koronaviruksen hypoteettinen nsp9, ja se edustaa Microhyla letovirus 1 -lajia Alphaletoviruksen Letovirinae-alaperheessä.nsp9:n sekundaarirakenteen elementtien tähteiden säilymistä voidaan järkeistää rakenteellisilla näkökohdilla laskostumis- tai tunnettujen RNA:ta sitovien ominaisuuksien säilyttämiseksi.Tämä päättely ei kuitenkaan näytä pätevän NNE:n säilyttämiseen, ja ennen tätä tutkimusta tripeptidisekvenssin vaihtelua rajoittavien rajoitusten luonne oli täysin hämärtynyt.
Määrittääksemme nsp9-NMPylaation ja NNE:n säilymisen tärkeyden koronaviruksen replikaatiossa, tuotimme HCoV-229E-mutantteja, jotka sisältävät nsp9:n N-terminaalisten tähteiden yhden tai kaksinkertaisen substituution, mikä osoittaa, että nsp9 NMPylaatio on haitallista in vitro.Ennen kuin aloitamme, yritämme vastata kysymykseen, vaikuttavatko nämä substituutiot (lähellä nsp8|9-katkaisukohtaa) C-terminaalisen pp1a-alueen proteolyyttiseen prosessointiin.Sarja nsp7-11-polyproteiinikonstrukteja, jotka sisälsivät vastaavia substituutioita nsp9:n N-päässä, tuotettiin E. colissa ja leikattiin rekombinantilla Mprolla.Mikään lisätyt substituutiot eivät vaikuta merkittävästi neljän kohdan (mukaan lukien nsp9:n viereinen kohta) proteolyyttiseen katkaisuun (SI-liite, kuva S9), lukuun ottamatta rakenteellisia muutoksia näissä proteiineissa, jotka häiritsevät Mpro-välitteistä nsp8|9-katkaisua (tai muuta) verkkosivusto.
Huh-7-solut transfektoitiin genomin pituisella HCoV-229E RNA:lla, joka koodaa Ala- tai Ser-substituutioita konservoituneissa NNE-tripeptideissä (N3825, N3826 ja E3827) nsp9:n N-päässä, mikä osoitti, että useimmat mutaatiot ovat tappavia.Pystyimme pelastamaan viruksen korvaamalla N-terminaalisen Asn:n Ser tai Ala (N2835A tai N2835S), mutta emme saaneet virusta talteen muilla NNE-sekvenssin yksittäisillä ja kaksoismutaatioilla (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (kuva 5D).
Nämä tulokset osoittavat, että koronavirusten replikaatio kudosviljelmässä on rajoitettua (sama tai samanlainen), mikä rajoittaa nsp9:n NMPylaatiokohtien luonnollista mutaatiota kehossa ja tukee tämän vasteen avainroolia koronavirusten elinkaaressa.
Viimeisessä koesarjassa tuotimme C-terminaalista His6-leimattua SARS-CoV-2 nsp12:ta ja nsp9:ää sekä kahta nsp12:n mutanttimuotoa E. colissa.Aktiivisen kohdan tähteet NiRAN- ja RdRp-domeeneissa olivat vastaavasti Käytä Alaa (kuvio 6A ja SI-liite, taulukko S2).K4465 SARS-CoV-2 nsp12:ssa vastaa K4135:tä HCoV-229E:ssä (SI-liite, kuva S2), joka osoittautui tarpeelliseksi NiRAN-aktiivisuuteen ja HCoV-229E:n replikaatioon (kuvat 3D ja E).Tämä tähde vastaa myös valtimoviruksen EAV nsp9 K94 -tähdettä, jonka aiemmin osoitettiin olevan välttämätön NiRANin itse-UMPylaatiolle/itse-GMPylaatiolle (16).Kuten kuviossa 6B esitetään, SARS-CoV-2 nsp12:lla on UMP-transferaasiaktiivisuutta käyttämällä nsp9:ää substraattina, kun taas nsp12_K4465A:n aktiivisen kohdan mutantti on inaktiivinen.Kaksinkertainen substituutio RdRp-motiivin C SDD:n tunnusomaisessa sekvenssissä ei vaikuta UMP-transferaasiaktiivisuuteen (kuvio 6B), mikä osoittaa, että RdRp-aktiivisuudella ei ole suoraa vaikutusta nsp9:n UMPylaatioon.Samanlaiset tiedot saatiin käyttämällä CTP:tä, GTP:tä ja ATP:tä (SI-liite, kuva S10).Yhteenvetona nämä tiedot osoittavat, että NiRAN-välitteisellä nsp9 NMPylaatiolla on konservatiivinen aktiivisuus koronaviruksissa, jotka edustavat ortokoronavirusalaperheen eri sukuja.
SARS-CoV-2 nsp12-välitteinen nsp9:n NMPylaatio.(A) Coomassie-värjätty SDS-polyakryyliamidigeeli, joka näyttää NMPylaatiotestissä käytetyn rekombinanttiproteiinin.Kontrollina käytettiin SARS-CoV-2 nsp12:n NiRAN-domeenin (K4465A) ja RdRp-domeenin (DD5152/3AA) aktiivista kohtaa sisältävää mutanttiproteiinia.Jäännöksen numerointi perustuu sijaintiin pp1ab:ssa.(B) UMPylaation havaitsemisen autoradiografia käyttäen nsp9-His6:ta ja [a-32P]UTP:tä nsp12-His6:n substraattina (villityyppi [wt] ja mutantti).Leimatun proteiinin molekyylimassa (kilodaltoneina) näkyy vasemmalla.
NiRAN-domeenit ovat yleensä konservoituneita Nidoviralesissa (16), mikä osoittaa, että ne katalysoivat entsymaattisia reaktioita, jotka ovat välttämättömiä Nidoviruksen replikaatiolle.Tässä tutkimuksessa pystyimme todistamaan, että koronaviruksen NiRAN-domeeni siirtää NMP:tä (syntynyt NTP:stä) nsp9:ään, mystiseen RNA:ta sitovaan proteiiniin, joka osallistuu viruksen replikaatioon (26 ?? 29 ), määrittääkseen sen luonnolliseksi kohteeksi ja koronavirus RTC:n kumppani.
NiRAN-domeenilla on kolme sekvenssimotiivia (AN, BN ja CN), jotka sisältävät hyvin pienen määrän tähteitä, jotka ovat säilyneet kaikissa perheissä monofyleettisessä, mutta erittäin erilaistetussa Nidovirales-järjestyksessä (8, 16).Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että ne liittyvät rakenteellisesti suurelta osin karakterisoimattomaan proteiinikinaasin kaltaisten proteiinien perheeseen, jota alun perin kutsuttiin SelO-perheeksi (17, 19, 22, 30, 31).SelO-sukuisissa proteiineissa on kinaasilaskoksia, mutta niistä puuttuu useita konservoituneita aktiivisia kohtia klassisissa kinaaseissa (22, 32).Aktiiviseen kohtaan sitoutuneiden ja spesifisten vuorovaikutusten stabiloimien ATP-molekyylien käänteisen orientaation perusteella SelO:n oletettiin ja myöhemmin vahvistettiin siirtävän AMP:ta (fosfaatin sijasta) proteiinisubstraattiin (22), kun taas toisella bakteerin SelO:n kaltaisella proteiinilla YdiU:lla on Äskettäin on osoitettu katalysoivan UMP:n kovalenttista kiinnittymistä eri proteiinisubstraattien Tyr- ja His-tähteisiin (33).
Vahvistaaksemme ja laajentaaksemme ennustetta koronaviruksen NiRAN-domeenin oletetuista aktiivisen kohdan tähteistä suoritimme koronaviruksen nsp12:n mutaatioanalyysin biokemiallisilla ja käänteisgenetiikan menetelmillä (kuva 3D ja E ja SI liite, kuva S3 ja taulukko) S1â S4).Tiedot osoittavat, että HCoV-229E K4135, R4178 ja D4280 korvaaminen Alalla eliminoi in vitro NMP-transferaasiaktiivisuuden ja viruksen replikaation soluviljelmässä (kuva 3D ja E ja SI-liitteet, kuva S3), mikä tukee niiden läsnäoloa NTP-y-fosfaatissa. (K4135, R4178) ja aktiivisen kohdan metalli-ionien koordinaatio (D4280).Konservoituneen Glu:n E4145A-substituutio linnunpesäviruksen alueella, jonka ennustettiin stabiloivan K4135 (17) -aseman, osoitettiin eliminoivan viruksen replikaation, mutta yllättäen aktiivisuus säilyi in vitro NMPylaatiomäärityksessä (kuvio 3D ja E ja SI-liite, kuva S3 ja taulukot S1–S4).Samanlainen havainto tehtiin, kun vastaava substituutio lisättiin Salmonella typhimuriumin (E130A) YdiU-homologiin (33).Yhdessä nämä tiedot tukevat tämän konservoituneen jäännöksen säätelytoimintoa katalyyttisen toiminnan sijaan.
Konservoituneen Phe-tähteen (F4281A) korvaaminen nestoviruksen alueella HCoV-229E NiRAN-domeenissa (8) johti NMPylaatioaktiivisuuden vähenemiseen in vitro ja viruksen replikaatioon merkittävään laskuun soluviljelmässä (kuvio 3D, E ja SI) liite, kuva S3).Tiedot ovat yhdenmukaisia tämän tähteen tärkeän säätelytoiminnon kanssa, kuten aiemmin esitetyn homologisen DFG-motiivin Phe-tähteen kanssa.Klassisissa proteiinikinaaseissa se on osa Mg2+ -sitoutumissilmukkaa ja auttaa kokoamaan ja säätelemään selkärankaa???Tehokkaan katalyyttisen aktiivisuuden edellyttämä (32, 34).K4116-tähteiden (preAN-aiheessa) korvaaminen Ala:lla ja Arg:lla eliminoi viruksen replikaation, ja odotetusti niillä oli erilaisia vaikutuksia NMP-transferaasiaktiivisuuteen in vitro riippuen lisätystä aminohapposivuketjusta (kuva 3D sekä E- ja SI-liitteet). , kuva S3).Toiminnalliset tiedot ovat yhdenmukaisia rakennetietojen kanssa, mikä osoittaa, että tämä jäännös on muodostanut vuorovaikutuksen ATP-fosfaatin kanssa (17).Muiden sisäkkäisten virusperheiden NiRAN-domeenissa HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116:n asema on Lys, Arg tai His (8) miehitetty, mikä osoittaa, että tämän spesifisen tähteen toiminnallinen rajoitus on lieventynyt.D4188A:n ja D4283A:n substituutio eliminoi tai vähentää voimakkaasti entsyymiaktiivisuutta ja eliminoi viruksen replikaation (kuvio 3).Nämä kaksi jäännöstä ovat säilyneet useimmissa (mutta ei kaikissa) sisäkkäisissä viruksissa (8), mikä osoittaa tärkeän perhespesifisen, mutta mahdollisesti ei-katalyyttisen toiminnan.Kontrollina käytettiin useiden muiden Lys- ja Asp-tähteiden (K4113A, D4180A, D4197A ja D4273A) Ala-substituutioita, jotka eivät ole säilyneet Coronaviridae- tai muissa Nestioviridae-perheissä (8).Kuten odotettiin, nämä substituutiot ovat suurelta osin siedettäviä, ja joissakin tapauksissa entsyymiaktiivisuus ja viruksen replikaatio heikkenevät (kuva 3 ja SI-liite, kuva S3).Kaiken kaikkiaan koronaviruksen mutageneesitiedot ovat hyvin yhdenmukaisia EAV NiRAN-RdRp:n (16) itse-GMP- ja käänteisgenetiikan tietojen kanssa, joissa EAV nsp9 (koronaviruksen nsp12 ortologi) jäännös K94 (vastaa HCoV-229E K4135:tä) toimii tärkeitä tehtäviä. R124 (vastaa R4178), D132 (vastaa D4188), D165 (vastaa D4280), F166 (vastaa F4281).Lisäksi HCoV-229E-mutageneesitiedot ovat yhdenmukaisia ja laajennettu aiemmin raportoitujen SARS-CoV-käänteisgenetiikan tietojen kanssa (16), aivan yhtä hyvin samankaltaisia kuin vastaavan CN-motiivin Phe-to-Ala-mutantille SARS-CoV_nsp12 havaitut tiedot. kuvattu fenotyyppi -F219A ja HCoV-229E_F4281A (kuva 3 D ja E ja SI liite, kuva S3 ja taulukko S1-S4).
Verrattuna EAV-ortologeihin (16), jotka suosivat selkeästi UTP:tä ja GTP:tä (itse-NMPylaatioreaktiossa), tutkimuksemme osoittaa, että koronaviruksen NiRAN-domeeni (jota edustavat HCoV-229E ja SARS-CoV-2) voidaan tehokkaasti hyödyntää. Kaikki neljä NMP:tä, vaikka UMP:tä suositaan hieman (kuvat 1 ja 3).Spesifisen NTP-kosubstraatin suhteellisen alhainen spesifisyys on yhdenmukainen äskettäin raportoidun SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 -superkomposiittirakenteen kanssa, jossa ADP-Mg2+ sitoutuu NiRANin aktiiviseen kohtaan, mutta ei adeniiniosaan. spesifisten vuorovaikutusten muodostumisesta (17).Tutkimuksessamme NMPylaatioreaktiossa käytetyllä nukleotidityypillä ei ole erilaista vaikutusta mutanttiproteiinin aktiivisuuteen (SI-liite, kuva S3), mikä osoittaa, että mikään näistä tähteistä ei liity läheisesti tietyn nukleoemäksen sitoutumiseen.Koronavirusten ja valtimovirusten NiRAN-domeeneissa havaittujen eri NTP-substraattipreferenssien rakenteellinen perusta ja mahdollinen biologinen merkitys on vielä tutkimatta;ne voivat olla totta tai ne voivat johtua niiden vastaavien tutkimusten rajoituksista.Tällä hetkellä ei voida sulkea pois sitä, että valtimoviruksen NiRAN-domeenin potentiaalisella NMPylaattoriaktiivisuudella (verrattuna aiemmin karakterisoituun itse-NMPylaatioaktiivisuuteen) on erilainen ko-substraattipreferenssi, kun otetaan huomioon, että valtimon ja koronaviruksen samankaltaisuus NiRAN-verkkotunnus on rajallaan.Sekvenssipohjainen vertailu (16).Verrattuna pseudokinaasiin SelO, joka käyttää Mg2+:aa kofaktorina, koronaviruksen ja valtimoviruksen NiRAN:n aktiivisuus on riippuvainen Mn2+:sta (16) (kuva 3C ja SI-liite, kuva S1).Mn2+-riippuvuus ja ilmeinen UTP-suositus on proteiini-NMPylaattoreiden epätavallinen ominaisuus, ja se on vasta äskettäin varmistettu Salmonella typhimuriumin YdiU-proteiinissa, joka katalysoi tiukkaa Mn2+-riippuvaista proteiinikaperoni-UMPylaatiota suojellakseen soluja stressin induktiolta Solu-ATP-pooli ( 33).
Äskettäin kuvattu rakenteellinen samankaltaisuus koronaviruksen NiRAN-domeenin ja solujen proteiinikinaasien välillä (17, 19) tarjoaa lisätukea NiRANin kyvylle liittää kovalenttisesti NMP:tä muihin tässä tutkimuksessa raportoimiin proteiineihin.Keskityimme mahdollisten NiRAN-kohteiden etsintään HCoV-229E ORF1a:n koodaamiin proteiineihin, joiden tiedetään suoraan tai epäsuorasti auttavan RTC:n ORF1b-koodaamaa replikaasia (12, 35).Kokeemme tarjoavat ratkaisevan todisteen nsp9:n tehokkaasta ja spesifisestä NMPylaatiosta (kuva 2).Jos kohdeproteiinia käytetään molaarisessa ylimäärässä, joka on 8-10 kertaa suurempi kuin entsyymin (nsp12) ylimäärä, varmistetaan, että nsp9 on täysin (mono)NMP-muokkautunut (kuvio 4).Päätimme, että nsp12:n ja nsp9:n välinen vuorovaikutus on lyhytikäinen eikä muodosta stabiilia kompleksia nsp9:n kanssa (muiden RTC-alayksiköiden puuttuessa).Tätä päätelmää tukevat proteiinien vuorovaikutustutkimukset SARS-CoV-proteomilla (35).MS-analyysi identifioi nsp9:n N-terminaalisen tähteen primaarisen amiinin NMPylaatiokohdaksi (SI-liite, kuva S5).Fosforamidaattisidoksen ja N-terminaalisen aminoryhmän muodostuminen erottaa NiRAN-välitteisen NMPylaatioaktiivisuuden Pseudomonas syringae SelO-välitteisestä AMPylaatioreaktiosta, joka katalysoi O-kytketyn AMP:n muodostumista Ser-, Thr- tai Tyr-tähteiden peptidiadduktissa ( 22), ja S. typhimurium YdiU muodostaa O-kytkettyjä (Tyr:n kanssa) ja N-kytkettyjä (His:n kanssa) peptidi-UMP-addukteja.SelO-proteiiniperheestä saatavilla olevat rajalliset tiedot osoittavat, että tämän suuren proteiiniperheen jäsenet eroavat suuresti peptidi-NMP-adduktien muodostumisessa.Tämä on mielenkiintoinen havainto, joka ansaitsee lisätutkimuksen.
Tässä tutkimuksessa saadut tiedot saivat meidät olettamaan, että nsp9:n NMPylaatio vaatii vapaan N-pään.Viruksen replikaation yhteydessä tämä saadaan aikaan nsp8|nsp9:n prosessointikohdan proteolyyttisellä pilkkoutumisella replikaasipolyproteiinissa pp1a, jota välittävät Mpro ja pp1ab.Useimmissa koronaviruksissa ero tämän spesifisen kohdan (HCoV-229E:ssä VKLQ|NNEI) ja kaikkien muiden koronaviruksen Mpro-pilkkomiskohtien välillä on se, että Asn (eikä toinen pieni jäännös, kuten Ala, Ser tai Gly) miehittää P1â???Sijainti (36).Varhaisissa tutkimuksissa saadut peptidien katkaisutiedot osoittivat, että nsp8|nsp9-kohdan katkaisutehokkuus oli alhaisempi kuin muiden kohtien, mikä osoittaa, että 1) tällä spesifisellä paikalla voi olla säätelevä rooli C-terminaalin oikea-aikaisessa koordinoidussa prosessoinnissa. pp1a-alue tai 2) a Erityisen konservoituneen nsp9:n N-pään rooli viruksen replikaatiossa (37).Tietomme (kuvio 5A) osoittivat, että nsp12 NMP-muokkaa tehokkaasti nsp9:n rekombinanttimuodon, jossa oli todellinen N-terminaalinen sekvenssi.N-terminaalinen reunustava sekvenssi poistettiin tekijä Xa:lla (nsp9-His6; SI-lisäys, taulukko S1) tai Mpro-välitteisellä katkaisulla (nsp7-11-His6; kuvio 5A ja SI-liite, taulukko S1).Tärkeää on, että leikkaamaton nsp9:tä sisältävä prekursori nsp7-11-His6 osoitti vastustuskykyä nsp12:n NMPylaatiolle, mikä on yhdenmukainen tietojemme kanssa, mikä osoittaa, että nsp9-NMP-addukti muodostuu N-terminaalisen primaarisen amiinin kautta (SI-liite, kuva S5) .Saadaksemme syvemmän ymmärryksen NiRAN-substraattispesifisyydestä, keskityimme sitten nsp9:n viereisiin N-terminaalisiin tähteisiin.Muiden proteiinien puuttuessa ne ovat rakenteellisesti joustavia, mikä estää niiden havaitsemisen nsp9:n leimaamattomassa muodossa (26 28, 38), mikä osoittaa niiden rajallisen luonnollisen vaihtelun Tämä johtuu tärkeästä sekvenssispesifisestä (ei sekundaarirakenteeseen liittyvästä) nsp9:n N-terminaalisen fragmentin toiminta.Tämän alueen konservoituneiden tähteiden ala-substituutiot (kuvat 5C ja D ja SI-liite, kuva S8) paljastavat, että N3826 on välttämätön nsp9:n NMPylaatiolle in vitro, kun taas N3825A- ja E3827A-substituutiot johtavat NMPylaation vähenemiseen, kun taas M3829A ja P3830A eivät. .Ilmeisesti vaikuttaa nsp9 NMPylaatioon.Vaikka N-terminaalisen Asn:n (N3825A, N3825S) substituutiolla on vain kohtalainen vaikutus nsp9:n NMPylaatioon ja viruksen replikaatioon soluviljelmässä (kuvio 5C ja D), Asn-tähdesekvenssin deleetio N-terminaalisesta 3825-NN-dipeptidistä Se on tappava viruksille, mikä osoittaa, että yksi Asn-tähde vaaditaan ennen toista tähdettä N-päässä, edullisesti Asn, vaikka näyttää siltä, että samanlaisten tähteiden korvaaminen voidaan osittain sietää (kuvio 5B, C ja D).Päättelemme, että 3825-NN-dipeptidi, erityisesti konservoitunut ja välttämätön N3826-tähde koronavirusalueella (SI-liite, kuva S6), varmistaa nsp9:n N-pään oikean sitoutumisen ja suuntautumisen NiRAN:n aktiivisessa kohdassa.
Kaikkien alaryhmien konservoituneen Glu:n korvaaminen Ala:lla (E3827A) säilyttää nsp9 NMPylaation in vitro, mutta on tappava viruksille soluviljelmässä (kuvat 5C ja D), mikä osoittaa tämän tähteen lisätoiminnon esimerkiksi avainvuorovaikutuksissa (NMPyloitu tai modifioimaton). ) nsp9:n N-pää ja muut viruksen replikaatioon liittyvät tekijät.Nsp9-mutaatiot eivät vaikuttaneet nsp9:n tai minkään viereisen nsp:n proteolyyttiseen prosessiin (39) (SI-liite, kuva S9), mikä osoittaa, että useiden havaittujen nsp9-mutaatioiden tappavat fenotyypit eivät johtuneet C-proteolyyttisen prosessin terminaalisen pp1a-alueen säätelyhäiriöstä. .
Yllä olevat tiedot tarjoavat todisteita siitä, että nsp8|9-katkaisukohdan Mpro-välitteisen käsittelyn jälkeen pp1a/pp1ab:ssa nsp9:n N-pää voidaan UMPyloida (tai osittain modifioida toisella NMP:llä).Lisäksi nsp9:n N-pään erinomainen säilyvyys (mukaan lukien yksittäiset ja muuttumattomat Asn-tähteet koronavirusperheessä) ja tässä tutkimuksessa saadut käänteiset geneettiset tiedot (kuvat 3E ja 5D) johtivat siihen johtopäätökseen, että kuvattu nsp9:n NMPylaatio on biologisesti sukua ja välttämätön koronaviruksen replikaatiolle.Tämän muunnelman toiminnalliset seuraukset jäävät tutkimatta esimerkiksi aiemmin kuvatun (epäspesifisen) nsp9:n (muuntamaton muoto) RNA:n sitoutumisaktiivisuuden (2628) suhteen.N-terminaalinen NMPylaatio voi myös vaikuttaa nsp9:n vuorovaikutukseen proteiini- tai RNA-substraattien kanssa tai erilaisten nelitasoisten kokoonpanojen muodostumiseen.Näitä on havaittu rakennetutkimuksissa ja niiden on vahvistettu liittyvän toiminnallisesti koronaviruksen replikaatioon, vaikkakin varsinkin sen puuttuessa.
Vaikka koronaviruksen NiRAN-domeenin kohdespesifisyys on vielä karakterisoitava tarkemmin, tietomme osoittavat, että koronaviruksen NiRAN-domeenin proteiinikohdespesifisyys on hyvin kapea.Vaikka avainaktiivisen kohdan tähteiden (8, 16) konservoituminen kaikkien nidovirusperheiden NiRAN-domeenissa tukee voimakkaasti näiden proteiinien konservoituneen NMPylaattorin aktiivisuutta, tämän domeenin substraattia sitovien taskutähteiden identiteetti. Säilyvyys ja säilyminen on edelleen karakterisoitavaa , ja ne voivat vaihdella eri Nidovirales-perheiden välillä.Samoin muiden sisäkkäisten virusten asiaankuuluvat kohteet on vielä määrittämättä.Ne voivat olla nsp9:n tai muiden proteiinien etäortologeja, koska viiden replikaasidomeenin ulkopuolella olevat sekvenssit, jotka ovat yleensä konservoituneita sisäkkäisissä viruksissa, ovat vähemmän konservoituneita (8), mukaan lukien Mpro:n ja NiRANin välinen genomiryhmä. Niiden joukossa nsp9 sijaitsee koronavirus.
Lisäksi emme voi tällä hetkellä sulkea pois mahdollisuutta, että NiRAN-verkkotunnuksella on lisäkohteita (mukaan lukien solukko).Tässä tapauksessa on syytä mainita, että tämän nousevan proteiinin NMPylaattorit (NMPylaattorit) (30, 31) bakteerihomologeilla näyttävät olevan "pääsäätelijät"?NMP moduloi erilaisia soluproteiineja säätelemään tai eliminoimaan niiden myöhempiä aktiivisuuksia ja siten näyttelemään roolia monissa biologisissa prosesseissa, kuten solun stressivasteessa ja redox-homeostaasissa (22, 33).
Tässä tutkimuksessa (kuvat 2 ja 4 ja SI-liite, kuvat S3 ja S5) pystyimme osoittamaan, että nsp12 siirsi UMP (NMP) -osan yhteen (konservoituneeseen) kohtaan nsp9:ssä, kun taas muita proteiineja ei modifioitu nsp9:ssä. käytetty Olosuhteissa tuetaan hyvin määriteltyä (eikä löysää) substraattispesifisyyttä.Tämän mukaisesti N-terminaaliseen nsp9 NMPylaatioon verrattuna nsp12:n oma NMPylaatioaktiivisuus on erittäin alhainen, sen havaitseminen vaatii pidemmän autoradiografian altistusajan ja nsp12-pitoisuuden 10-kertaista lisäystä käytetään.Lisäksi MS-analyysimme ei pystynyt tarjoamaan todisteita nsp12:n NMPylaatiosta, mikä viittaa siihen, että NiRAN-domeenin itse-NMPylaatio on (parhaimmillaan) toissijainen aktiivisuus.On kuitenkin huomattava, että muut tutkimukset ovat antaneet alustavaa näyttöä siitä, että bakteeri-NMPylaattorin itse-AMPylaatiotila voi hallita niiden NMPylaatioaktiivisuutta muilla proteiinisubstraateilla (22, 33).Siksi tarvitaan lisää tutkimusta EAV nsp9:lle (16) ja koronaviruksen nsp12:lle (tämä tutkimus) raportoitujen itse-NMPylaatiotoimintojen mahdollisten toiminnallisten vaikutusten tutkimiseksi, mukaan lukien ehdotettu chaperonin kaltainen vaikutus C-terminaalisen RdRp-domeenin laskostumiseen ( 16) ).
Aiemmin on harkittu useita hypoteeseja, jotka koskevat nidoviruksen NiRAN-domeenin mahdollisia alavirran toimintoja, mukaan lukien RNA-ligaasi, RNA-suojattu guanylaattitransferaasi ja proteiinin esikäsittelyaktiivisuus (16), mutta mikään niistä ei ole yhteensopiva saatavilla olevien alavirran toimintojen kanssa.Seuraavissa paikoissa saadut tiedot ovat täsmälleen samassa ajassa ilman lisäoletuksia.Tässä tutkimuksessa saadut tiedot vastaavat parhaiten (mutta ei voi todistaa), että NiRAN-domeeni on osallisena proteiinin indusoiman RNA-synteesin aloittamisessa.Aikaisemmin uskottiin, että NiRAN-alueen toiminta 5??Nämä ja muiden tietojen tuki eivät vaikuta ²-RNA:n rajoitus- tai RNA-ligaatioreaktioihin.Siksi esimerkiksi NiRANin aktiivisen kohdan katsotaan sisältävän konservoituneen Asp:n yleisenä emäksenä (D252 Pseudomonas syringae SelO:ssa; D4271 HCoV-229E pp1ab:ssa; D208 SARS-CoV-2 nsp12:ssa) (SI-liite, kuva 2) ).S2) (17, 22, 33), kun taas katalyysi ATP-riippuvaisessa RNA-ligaasissa ja RNA:ta sulkevassa entsyymissä suoritetaan kovalenttisella entsyymi-(lysyyli-N)-NMP-välituotteella, joka sisältää muuttumattoman Lys-tähteen ( 41).Lisäksi koronaviruksen NiRAN:n huomattava sekvenssipohjainen spesifisyys konservoituneille proteiinikohteille ja rento spesifisyys NTP-substraateille (ensisijaisesti UTP) vastustaa NiRAN-välitteistä capping-entsyymiä tai RNA-ligaasin kaltaisia toimintoja.
On selvää, että tarvitaan paljon lisätyötä nsp9-UMP:n (nsp9-NMP) mahdollisen roolin tarkistamiseksi ja, jos se on todistettu, tarkentamiseksi proteiinin aiheuttamassa RNA-synteesissä, mikä yhdistää useita mielenkiintoisia, mutta (toistaiseksi) aiemmin raportoituja raportteja. .Yksittäisiä havaintoja.On esimerkiksi määritetty, että koronaviruksen negatiivisen juosteen RNA:n loppu alkaa oligo(U)-juosteesta (42, 43).Tämä havainto on yhdenmukainen sen ajatuksen kanssa, että negatiivisäikeisen RNA:n synteesi käynnistyy sitomalla nsp9:n UMPyloitu muoto poly(A)-häntään (laukaisimet), mitä voi edistää sen RNA:n sitoutuminen. toinen RTC-proteiini.Nsp9:n tarjoamaa UMP-osaa voidaan sitten käyttää "alukkeena" nsp7/8/nsp12-välitteiselle oligouridylaatiolle käyttämällä genomisen RNA:n 3??²-poly(A) häntää tai toista oligoa (A) sisältävää sekvenssiä. toimii templaattina, samanlainen kuin picornaviruksen VPg-proteiinille perustettu mekanismi (44).Entä jos ehdotus on "ei-normatiivinen"????(Proteiini-indusoidun) negatiivisäikeisen RNA-synteesin aloitus tarjoaa linkin havaintoihin, mikä osoittaa, että koronaviruksen negatiivijuosteisen RNA:n päässä on UMP (UTP:n sijaan) (42), minkä katsotaan osoittavan, että Nukleiinihappo Dicer katkaisee tuntemattoman uridiinispesifisen endonukleaasin fosforyloiman pään.Jos tämä nukleiinihapon hydrolyyttinen aktiivisuus varmistetaan, se voi auttaa vapauttamaan nsp9:n oligomeerisen UMPyloidun muodon syntyvän negatiivisen juosteen 5 ²:n päästä.Nsp9:n mahdollinen rooli proteiinien esikäsittelyssä on myös yhdenmukainen aiempien käänteisten geneettisten tutkimusten kanssa, jotka ovat osoittaneet, että nsp9 (ja nsp8) vuorovaikuttavat kriittisesti ja spesifisesti konservoituneen cis-vaikutteisen RNA-elementin kanssa lähellä koronaviruksen genomin 3-päätä.45).Tämän raportin mukaan näitä aikaisempia havaintoja voidaan nyt tarkastella uudelleen ja laajentaa lisätutkimuksilla.
Yhteenvetona, tietomme määrittelivät patentoidun sisäkkäisen virusentsyymitunnisteen spesifisen aktiivisuuden, joka on liitetty RdRp:hen N-päässä.Koronaviruksessa tätä äskettäin löydettyä NiRAN-välitteistä UMPylaattori/NMPylaattori-aktiivisuutta käytetään luottamaan Mn2+:aan ja viereisiin Asn-tähteisiin ja aiheuttamaan (matalaenergia) fosforamidaattisidosten muodostumista N-terminaalisen primaarisen amiinin kanssa.Mpro-välitteisen katkaisun kautta nsp8|9-katkaisukohdassa nsp9-kohdetta voidaan käyttää NMPylaatioon, mikä osoittaa proteaasin ja NiRAN-domeenin välisen toiminnallisen kytkennän, joka ulottuu RdRp:hen.Keskeisten tähteiden säilyminen nsp12:n NiRAN-aktiivisessa kohdassa ja nsp9-kohteessa yhdistettynä kahdesta koronaviruksesta, mukaan lukien SARS-CoV-2, saatuihin tietoihin, tarjoaa vahvan todisteen siitä, että nsp9 NMPylaatio on koronavirus Konservatiiviset ominaisuudet ovat myös avainaskel viruksen replikaatiossa.Saatavilla olevat tiedot johtavat siihen johtopäätökseen, että nsp9:n NMPyloidun muodon erityinen rooli proteiinin indusoimassa RNA-synteesissä on kohtuullinen skenaario koronavirukselle ja muille sisäkkäisille viruksille, ja NiRAN voi kohdistaa myös muita tunnistamattomia proteiineja.Säädä virusta.Isännän vuorovaikutus.Jos varmistetaan, proteiinialukkeiden osallistuminen viruksen RNA-synteesiin lisää Mpro/3CLpro- ja RdRp-domeenien sekvenssiaffiniteettia aiemmin havaitun koronaviruksen ja pikornaviruksen kaltaisen superryhmän välillä (9), jotka on nyt yhdistetty äskettäin perustettuihin Pisonivirites 46) luokassa.
Tietomme osoittavat myös, että tässä tutkimuksessa tunnistettuja perus-, selektiivisiä ja konservatiivisia entsyymiaktiivisuuksia voidaan käyttää viruslääkkeiden kohteina.Yhdisteet, jotka häiritsevät konservoituneen nsp9:n N-pään sitoutumista (ja myöhempää modifikaatiota) NiRANin aktiivisessa kohdassa, voidaan kehittää tehokkaiksi ja monipuolisiksi viruslääkkeiksi, jotka soveltuvat erilaisista (ala)suvun infektioista peräisin olevien eläinten ja ihmisten koronavirusten hoitoon. mukaan lukien SARS-CoV-2 ja Lähi-idän hengitysteiden oireyhtymä koronavirus.
Tässä tutkimuksessa tuotetun koronavirusproteiinin koodaava sekvenssi monistettiin RT-PCR:llä käyttämällä RNA:ta, joka oli eristetty Huh-7:stä, joka oli infektoitu HCoV-229E:llä tai Vero E6:lla, joka oli infektoitu SARS-CoV-2:lla, ja insertoitiin käyttämällä tavanomaisia kloonausmenetelmiä.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) tai pASK3-Ub-CHis6 (47) -ekspressiovektori (SI-liite, taulukot S1 ja S2).Yksittäiset kodonisubstituutiot otettiin käyttöön PCR-pohjaisella kohdennetulla mutageneesillä (48).MBP-fuusioproteiinin tuottamiseksi E. coli TB1 -solut transformoitiin sopivalla pMAL-c2-plasmidikonstruktilla (SI-liite, taulukko S1).Fuusioproteiini puhdistettiin amyloosiaffiniteettikromatografialla ja pilkottiin tekijällä Xa.Myöhemmin C-terminaalinen His6-merkitty proteiini puhdistettiin Ni-immobilisoidulla metalliaffiniteettikromatografialla (Ni-IMAC), kuten aiemmin on kuvattu (49).Ubikitiinifuusioproteiinin tuottamiseksi E. coli TB1 -solut käyttivät sopivaa pASK3-Ub-CHis6-plasmidikonstruktia (SI-liite, taulukot S1 ja S2) ja pCGI-plasmidi-DNA:ta, joka koodaa ubikvitiinispesifistä C-terminaalista hydrolaasia 1:tä (Ubp1).Muutos (47).C-terminaalinen His6-merkitty koronavirusproteiini puhdistettiin aiemmin kuvatulla tavalla (50).
HCoV-229E nsp12-His6:n itse-NMPylaatiotesti suoritettiin EAV nsp9:ssä kuvatulla tavalla (16).Lyhyesti sanottuna nsp12-His6 (0,5 uM) sisältää 50 mM 4-(2-hydroksietyyli)-1-piperatsiinietaanisulfonihappoa (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM ditiotreitolia (DTT), 6 mM MnCl2:ta, 25 uM puskuria määritetty NTP ja 0,17 uM vastasivat [a32-P]NTP:tä (3 000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) 30 °C:ssa 30 minuutin ajan.Kaikissa muissa (standardeissa) nsp12-välitteisen nsp9-NMPylaation NMPylaatiomäärityksissä reaktio-olosuhteet säädetään seuraavasti: nsp12-His6 (0,05 uM) ja nsp9-His6 (4 uM) 50 mM HEPES-KOH:n (pH 8) läsnä ollessa. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 uM indikoitua NTP:tä ja 0,17 uM yhteensopivaa [a32-P]NTP:tä.10 minuutin 30 °C:ssa inkuboinnin jälkeen reaktionäyte sekoitettiin SDS-PAGE-näytepuskurin kanssa: 62,5 mM tris(hydroksimetyyli)aminometaani-HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5 % SDS, 10 % glyseroli ja 0,005 % bromifenoli. sininen.Proteiini denaturoitiin kuumentamalla 90 °C:ssa 5 minuuttia ja erotettiin 12 % SDS-PAGE:lla.Geeli kiinnitetään ja värjätään Coomassie Brilliant Blue -liuoksella (40 % metanolia, 10 % etikkahappoa, 0,05 % Coomassie Brilliant Blue R-250), väri poistetaan ja altistetaan fosforoivalle kuvantamisnäytölle 20 tunnin ajan (nsp12:n havaitsemiseksi NMPylaatiosta). tai (enintään) 2 tuntia (nsp9 NMPylaation arvioimiseksi).Typhoon 9200 -kuvalaitetta (GE Healthcare) käytettiin näytön skannaamiseen ja ImageJ:tä signaalin voimakkuuden analysoimiseen.
MS-analyysissä käytettiin 1 uM nsp12-His6 ja 10 uM nsp9 (ilman heksahistidiinimerkkiä) NMPylaatioanalyysissä (SI-liite, taulukko S1) ja 500 uM UTP:n ja GTP:n lisättyä konsentraatiota.Niiden pitoisuudesta ja odotetusta proteiinin laadusta riippuen käytettiin Waters ACQUITY H-Class HPLC-järjestelmää, joka oli varustettu MassPrep-kolonnilla (Waters), suolan poistamiseen 1-10 µl:sta puskuroituja proteiiniliuoksia verkossa.Proteiini, josta suola on poistettu, eluoidaan Synapt G2Si -massaspektrometrin (Waters) sähkösumutus-ionilähteeseen seuraavan puskurin A (vesi/0,05 % muurahaishappo) ja puskurin B (asetonitriili/0,045 % muurahaishappoa) gradientin kautta, ja kolonnin lämpötila on 60 °C ja virtausnopeus 0,1 ml/min: eluointi isokraattisesti 5 % A:lla 2 minuuttia, sitten lineaarinen gradientti 95 % B:hen 8 minuutin sisällä ja 95 % B:n ylläpito toiset 4 minuuttia.
Havaitaan positiivisia ioneja, joiden massa on 500-5000 m/z.Glu-fibrinopeptidi B mitataan 45 sekunnin välein automaattista massaryömintäkorjausta varten.Käytä MassLynx-instrumenttiohjelmistoa MaxEnt1-laajennuksella keskimääräisen spektrin purkamiseen perusviivan ja tasoituksen jälkeen.
UMPyloitu HCoV-229E nsp9 digestoitiin lisäämällä sekvensointiluokan modifioitua trypsiiniä (Serva) ja inkuboitiin yön yli 37 °C:ssa.Peptidien suolan poistamiseen ja konsentroimiseen käytettiin Chromabond C18WP -spinkolonnia (osanumero 730522; Macherey-Nagel).Lopuksi peptidi liuotettiin 25 ul:aan vettä, joka sisälsi 5 % asetonitriiliä ja 0,1 % muurahaishappoa.
Näytteet analysoitiin MS:llä käyttäen Orbitrap Velos Pro -massaspektrometriä (Thermo Scientific).Lopullinen nanoâ HPLC-järjestelmä (Dionex), joka on varustettu mukautetulla päähän asennettavalla 50 cm??75 μm C18 RP -kolonni pakattu 2,4 μm magneettihelmillä (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Yhdistä massaspektrometriin online-tilassa Proxeon nanospray -lähteen kautta;injektoi 6 µl trypsiinihajotusliuosta 300 µm:n sisähalkaisijaan ×??1 cm C18 PepMap esikonsentraatiokolonni (Thermo Scientific).Käyttämällä liuottimena vettä/0,05 % muurahaishappoa näyte kerättiin automaattisesti ja siitä poistettiin suola virtausnopeudella 6 µl/min.
Seuraavia gradientteja vesi/0,05 % muurahaishappo (liuotin A) ja 80 % asetonitriili/0,045 % muurahaishappo (liuotin B) käytettiin tryptisten peptidien erottamiseen virtausnopeudella 300 nl/min: 4 % B:lle 5 minuuttia, sitten 30 A lineaarinen gradientti 45 % B:hen minuuteissa ja lineaarinen nousu 95 % liuottimeen B 5 minuutissa.Liitä kromatografinen pylväs ruostumattomasta teräksestä valmistettuun nanoemitteriin (Proxeon) ja ruiskuta eluentti suoraan massaspektrometrin kuumennettuun kapillaariin 2 300 V:n potentiaalilla. Orbitrap-massaanalysaattorin 60 000:n resoluutiolla suoritettava tutkimus on yhdistetty. vähintään kolmella datalla MS/MS-skannaus, dynaamisesti poissuljettu 30 sekunniksi, käyttäen lineaarista ioniloukun törmäyksen aiheuttamaa dissosiaatiota tai korkeamman energian törmäysdissosiaatiota yhdistettynä kiertoradan havaitsemiseen. Resoluutio on 7 500.
Postitusaika: 03.08.2021